蒙娜丽莎的微笑之谜一直让世人津津乐道，但是500年以来，人们一直对”蒙娜丽莎”的神秘微笑莫衷一是。从不同的观者或在不同的时间去看，每一个人的感受似乎都会有所不同。有时觉得她笑得十分的舒畅温柔，有时又显得相当的严肃，有时像是略含哀伤，有时甚至也会显出一丝讥嘲和揶揄。在一幅画当中，光线的变化不能像在雕塑当中产生那样大的差别。但是在蒙娜丽莎的脸上，微暗的阴影也会时隐时现，而且还为她的双眼与唇部披上了一层神秘的面纱。然而人的笑容主要表现在眼角和嘴角之上，达•芬奇却偏把这些部位画得若隐若现的，由于有十分明确的界线，因此才会有这令人捉摸不定的“神秘的微笑”。
荷兰的阿姆斯特丹当中的一所大学应用“情感识别软件”则分析出蒙娜丽莎的微笑之谜当中所包含的内容及比例：高兴占 83％，厌恶占 9％，恐惧占 6％，愤怒则占 2％。哈佛大学的神经科专家玛格丽特•利文斯通博士说，蒙娜丽莎的微笑则会时隐时现，但是它也与人体的视觉系统直接有关，而不是因为画中人的表情有多么的神秘莫测。利文斯通博士是通过视觉神经活动方面的重要权威，主要所研究的眼睛与大脑对不同对比和光暗的一种极其强烈的反应。利文斯通说：“笑容经常会忽隐忽现，则是由于观看者突然改变了眼睛的重要位置。”她表示，人类的眼睛内有两个不同部分接收影像。中央部分(即视网膜上的浅窝)负责分辨颜色、细致印记。环绕浅窝的外围部分则留意黑白﹑动作和阴影。
据利文斯通说，当人们看着一张脸时，眼睛多数都集中在注视着对方的双眼。假如人们的中央视觉放在蒙娜丽莎的双眼，较不准确的外围视觉便会落在她的嘴巴上。由于外围视觉并不注重细微之处，无形中突出了颧骨部位的阴影。如此一来，笑容的弧度便显得更加大了。不过，当眼睛直视蒙娜丽莎的嘴巴，中央视觉便不会看到阴影。利文斯通说：“如果看着她的嘴巴，便永远无法捕捉她的笑容。”蒙娜丽莎的微笑之谜也是若隐若现的，它同时也源于人们的目光在不断的转移。利文斯通指出，若要临摹《蒙娜丽莎》，描绘口部时便要望着别处。
1993年，加拿大美术史家苏珊•吉鲁公布了一项令人震惊的研究成果。她说蒙娜丽莎那倾倒无数观赏者的口唇，是一个男子裸露的脊背。这一论断既新鲜又荒诞，然而论证是有力的。蒙娜丽莎的微笑之谜主要是因为这幅画集画家、雕刻家、建筑师、工程师及科学家等多种才艺于一身的达•芬奇，可谓是个“怪杰”。他喜欢穿粉红色外套，在胡须上毫无顾忌地涂上五颜六色，还常称自己解剖过不下30具死尸。他还是个左撇子，习惯从右到左倒着书写，别人要借助镜子才能读出他写的东西。因此借助镜子亦不失为欣赏者读画的一种方法。旋转90度后从镜中看蒙娜丽莎抿着的笑唇，恰好是一个背部线条分明的结实男性脊背以及左臂和肘部的一角；再说，表现人体美和呼唤人性的觉醒，既是大师的人生哲学，又是他的艺术观。
确实，在不同角度不同光线下欣赏这幅画，人们都会得到不同的一种感受。蒙娜丽莎的微笑之谜主要是因为那微笑时而温文尔雅，时而安详严肃，时而略带哀伤，时而又有几分讽嘲与揶揄，神秘莫测的微笑显露出人物神秘莫测的心灵活动。几百年来，“微笑”的新解层出不穷。诸如微笑不露皓齿是因原型虽典雅美丽却口齿不齐；原型因爱女夭折，忧郁寡欢，难掩凄楚之态；更有甚者，把蒙娜丽莎从贵妇宝座上推落下来，把原型贬为妓女，故而微笑中带着讥嘲和揶揄。美国马里兰州的约瑟夫•鲍考夫斯基博士认为：“蒙娜丽莎压根就没笑，她的面部表情很典型地说明她想掩饰自己没长门牙。”
法国里昂的脑外科专家让•雅克•孔代特博士认为蒙娜丽莎刚得过一次中风，请看，她半个脸的肌肉是松弛的，脸歪着所以才显得微笑。 英国医生肯尼思•基友博士相信蒙娜丽莎怀孕了。他的根据是：她的脸上流露出满意的表情，皮肤鲜嫩，双手交叉着放在腹部。性学专家推测：蒙娜丽莎刚刚经历了性高潮，所以才表现出令世人倾倒的微笑。对于蒙娜丽莎的微笑之谜还有一种近乎无稽之谈的说法：她的表情就像吃了苯氨基亚胺似的，显得很陶醉，这是吃完巧克力后人体内产生的一种欢愉激素。这种说法很少有人相信，因为当时还没有巧克力呢。 比利时安特卫普大学人类学教授辛科尔 肯瑞尔认为蒙娜丽莎有这样的微笑是因为她把饭吃饱了，因为她嘴角的弧度和她手轻放在自己的腹部上的动作与人类在饱食一顿之后的反应完全相同。画中，左边的地平线比右边的低，蒙娜丽莎的左侧看上去比右侧大。历史上左边代表女性，体现达•芬奇崇拜女性。其实蒙娜丽莎与达芬奇的自画像有很多共通之处，埃及传说中主管男性生殖器的神叫阿蒙（Amon），主管女性生殖器的神叫伊西斯（Isis）——古代文字中曾将其读做LISA，因此Mona Lisa就是暗示AMON LISA，即蒙娜丽莎非男非女，是两性的结合体。
按照以往的说法，达•芬奇的《蒙娜丽莎》收藏于巴黎的罗浮宫。但在收藏界却有一种说法称，挂在卢浮宫的不是《蒙娜丽莎》，真正的《蒙娜丽莎》是在伦敦一所公寓的墙上。对于蒙娜丽莎微笑之谜人们也颇有兴趣。同时将这间寓所和这幅作品的保管者普利策博士说，《蒙娜丽莎》完成后，作品就留在了丽莎•德•佐贡多家。后来，又有一个贵族请达•芬奇为他的情妇画一幅肖像，这个被称为“拉乔康达”（意为“微笑的 人儿”）的女子，和蒙娜丽莎长得很像。于是，一时懒惰的达•芬奇把《蒙娜丽莎》的脸部换成拉乔康达。画作完成后，那个贵族抛弃了拉乔康达，因而没有买下这幅画。后来达•芬奇应弗朗西斯一世的邀请去法国，带去了这幅画。普利策说，使卢浮宫增添光辉的是拉乔康达的肖像画。《蒙娜丽莎》后来流落到英格兰，本世纪初被一家博物馆馆长、艺术鉴赏家威廉•布莱克买下，后来又为瑞士一财团收购，普利策便是其中的成员。
本世纪初，曾经有许多人大规模地复制、伪造艺术名作，有理由怀疑伦敦的那幅是赝品。蒙娜丽莎的确微笑之谜让人们对这幅画深感不解。但是，普利策博士对他的这幅画的真实性深信不疑。他用显微摄影技术证实，伦敦这幅画上的指纹同达•芬奇其他作品上的指纹相同；根据记载，蒙娜丽莎比拉乔康多年轻19岁，被画时披着一条表示悼念的面纱，在两幅画中，只有伦敦那幅显示一个更显年轻的女人披着漂亮的面纱；另一个证据是，拉斐尔当年在达•芬奇作这幅画时曾经作过速写，速写中的蒙娜丽莎背后有两根圆柱，这两根圆柱出现在伦敦的肖像画里，而卢浮宫那幅的背景是山崖、小径、石桥、树丛与潺潺的流水。 几百年以来，不少收藏家各自声称他们藏有真正的《蒙娜丽莎》,数量居然达60幅之多。更有趣的是，美国缅因州伯特兰美术馆在1984年收到一幅《不微笑的蒙娜丽莎》，经测定，此画确实是当年达•芬奇的手笔，画中的人物除了不微笑以外，其余都酷似蒙娜丽莎本人。专家由此推测，这幅《不微笑的蒙娜丽莎》可能是作者同时画的一幅底稿。关于蒙娜丽莎的微笑之谜还有一种说法认为目前卢浮宫内收藏的《蒙娜丽莎》是一幅赝品，其依据在于1911年发生的那起盗窃案。在那起盗窃案中，《蒙娜丽莎》失窃。两年后，它出现在意大利，但是画面上蒙娜丽莎身后两旁的廊柱已经被切掉了。几年后，《蒙娜丽莎》被归还卢浮宫。但许多专家都认为，这次失而复得只是一场烟幕，真正的《蒙娜丽莎》已经被一位富有的收藏家重金收购，挂在卢浮宫内的只是一件赝品而已。
《蒙娜丽莎》数百年来一直被誉为最名贵的肖像画，60年代估计此画价值已达1亿美元。经过政府允许，从1962年12月14日至1963年3月12日，先后到美国的华盛顿和纽约市展出，对于蒙娜丽莎的微笑之谜早已经轰动了全美国，许多人专程从外地赶来，一睹为快。由于参观的人太多，据说展览会规定每个观众只能在《蒙娜•丽莎》画像前面停留3秒钟。以后该画又借到日本展览，轰动的程度更胜于美国，据说每位观众只能看2秒钟。
加利福尼亚大学教授卡罗•佩德雷蒂认为，蒙娜丽莎身后的背景是意大利中部阿雷佐市布里阿诺桥附近的景色。佩德雷蒂的证据是，达•芬奇出生在距阿雷佐约100公里的芬奇镇，并曾经在阿雷佐生活过，这一地区的原始景观与《蒙娜丽莎》的背景几乎完全一样，因此，达•芬奇很有可能采用这一地区的田园景色作为《蒙娜丽莎》的背景。当佩德雷蒂的这一观点在达•芬奇绘画国际研讨会
宣布后，许多美术史专家都对他的研究结果表示肯定。500多年来历史学家们一直为达•芬奇名画《蒙娜丽莎》的原型众说纷纭，争论不休。尤其是画中蒙娜丽莎的微笑之谜也是最难让人难以理解的。最近，意大利佛罗伦萨市一位普通教师吉乌塞普•帕兰蒂又提出了新的说法，蒙娜丽莎是一位有5个孩子的“家庭主妇”。 据英国《每日电讯报》1日报道，帕兰蒂对佛罗伦萨市档案进行了长达25年的研究，而后得出一个结论：《蒙娜丽莎》原型是达•芬奇父亲一位朋友的妻子丽莎•格拉迪尼，她是一名有5个子女的家庭主妇。据帕兰蒂考证，丽莎在1495年16岁时嫁给佛罗伦萨丝绸商人弗兰西斯科•吉奥康杜，而吉奥康杜则是达•芬奇父亲皮耶罗的好友兼邻居。丽莎是吉奥康杜的第二任妻子。这对夫妻的感情很好，育有5个子女。吉奥康杜在自己的遗嘱中称，丽莎是他“心爱的”和“忠实的”的妻子。
帕兰蒂认为，《蒙娜丽莎》的画像完成于丽莎24岁那年。达•芬奇的父亲安排了一切，自己花钱让儿子为朋友的妻子画了这幅画。当时达•芬奇正被一场财务纠纷所困扰。他的父亲大概想通过这种方式来帮助自己的儿子。通过蒙娜丽莎的微笑之谜在关于《蒙娜丽莎》原型的传说中，有人说画中人是当时佛罗伦萨城内的一个名妓，也有人说画中人是达•芬奇本人的女人版自画像。去年，一个名为谢文•纽兰德的美国教授声称，他已经发现了《蒙娜丽莎》微笑背后的真正秘密。《蒙娜丽莎》脸上之所以永远带着微笑，是因为画中的主人当年在做达•芬奇的模特儿时正好怀了身孕，是一个母亲对新生命即将诞生时产生的那种神秘的微笑。目前，帕兰蒂正趁暑假期间把自己的研究成果整理成书，计划在8月正式出版发行。达•芬奇《蒙娜丽莎》原画蔵于巴黎卢浮宫。但是几百年来，收藏家们声称自己收藏的《蒙娜丽莎》画作竟达60多幅。
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